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文库知几多——NGS文库浓度测定方法剖析

产品时间:2022-03-28 00:57

简要描述:

qPCR仪器主流的品牌有Thermofisher、ROCHE、BIO-RAD。qPCR法涉及到PCR扩增历程在PCR扩增时特异性的引物仅会定量两头讨论毗连完整的文库(即可测序的文库)可清除单端或双端都不毗连讨论的不行测序文库的滋扰是现在业内举行文库定量最推荐的方法。 由此可看出准确可靠的文库浓度一方面决议了一张测序芯片的产出另一方面决议了混淆文库中各个子文库的产出。明确了文库浓度检测的重要性下面我们来聊聊几种常见的文库浓度检测方法。...

详细介绍
本文摘要:qPCR仪器主流的品牌有Thermofisher、ROCHE、BIO-RAD。qPCR法涉及到PCR扩增历程在PCR扩增时特异性的引物仅会定量两头讨论毗连完整的文库(即可测序的文库)可清除单端或双端都不毗连讨论的不行测序文库的滋扰是现在业内举行文库定量最推荐的方法。 由此可看出准确可靠的文库浓度一方面决议了一张测序芯片的产出另一方面决议了混淆文库中各个子文库的产出。明确了文库浓度检测的重要性下面我们来聊聊几种常见的文库浓度检测方法。

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qPCR仪器主流的品牌有Thermofisher、ROCHE、BIO-RAD。qPCR法涉及到PCR扩增历程在PCR扩增时特异性的引物仅会定量两头讨论毗连完整的文库(即可测序的文库)可清除单端或双端都不毗连讨论的不行测序文库的滋扰是现在业内举行文库定量最推荐的方法。

由此可看出准确可靠的文库浓度一方面决议了一张测序芯片的产出另一方面决议了混淆文库中各个子文库的产出。明确了文库浓度检测的重要性下面我们来聊聊几种常见的文库浓度检测方法。

图2

1、如果上机lane的浓渡过低则导致数据产出少将不能获得足够的测序数据需要补测以到达需要的数据量增加了测序用度和测序周期。

对于illumina 测序平台准确的文库浓度是获得高质量测序数据的前提因为:

2、如果上机lane的浓渡过高将发生低质量的测序数据甚至会导致测序失败。

荧光染料法的原理是:荧光染料与特异性的靶分子(DNA、RNA或者卵白质)联合后发出的荧光强度比未联合前的荧光强度高许多可以淘汰游离荧光对配景信号的滋扰且所发生的荧光强度与特异性靶分子的浓度成正比这样纵然在杂质污染条件下也不会受到滋扰从而获得可靠的浓度。

图1

接纳紫外吸收法举行浓度定量的常见仪器有NanoDrop分光光度计(如图1)NanoDrop分光光度计操作轻便迅速但缺点是无法区分DNA、RNA、降解核酸、游离核苷酸及其它杂质此外待测样品的浓度小于100ng/ul时检测效果的变异度增大可信度不高因此该仪器更推荐用于检测提取后的DNA或者RNA的质量通过比力A260/A280和A260/A230的比值判断提取后核酸的纯度。纯RNA的A260/A280 ≥2.0DNA的A260/A280 ≥1.8当样品中杂质含量较高时比值下降RNA和DNA的比值划分低于2.0和1.8时建议纯化除去杂质。

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紫外吸收法的原理是:核苷、核苷酸、核酸的组成身分中都有嘌呤、嘧啶碱基这些碱基都具有共轭双键在紫外光区的250-280nm处有强烈的光吸收作用最大吸收值在260nm左右因此可以使用核酸的紫外吸收性举行浓度定量。

图3

一、 紫外吸收法

三、 实时荧光定量PCR法(qPCR法)

此外现在主流的illumina测序仪Novaseq 6000每张S4测序芯片可以产出至少3.2T的数据而单个样品需要的数据量远远小于一张芯片的产出因此通常将多个样品混淆到一起举行测序后续再凭据每个样品建库时用的index标签来区分;混淆到一起的各个样品的产出理论上与其物质的量占比成正比举个例子:假设只有A和B两个样品物质的量各占50%则产出100G数据时理论上A有50GB有50G;当A占90%B占10%产出100G数据时理论上A为90GB为10G。

最后我们用一个表格来总结3种浓度检测方式吧。

实时荧光定量PCR技术(qPCR法)是荧光检测技术和PCR技术的联合在PCR反映体系中加入荧光基团通过实时监测整个PCR历程中荧光信号的变化情况反映浓度的变化情况最后通过已知浓度的尺度曲线盘算未知样品的浓度。

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关于NGS文库质检的事上次我们聊了文库片段方面 文库知几多——NGS文库质检剖析(点击检察)今天我们来聊聊文库浓度方面。

二、 荧光染料法

相信不少老师对于浓度检测也存在一些疑惑:为什么各家公司检测的效果差异如此庞大?下面就这个情况小编来分享一些小我私家的想法。

最后小编再分享一些小我私家的履历由于荧光染料法无法区分单端或双端都不毗连讨论的不行测序文库获得的浓度可能偏高因此qPCR法成为了文库浓。


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本文来源:鸭脖-www.jnshuangrui.com

 


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